長讀長單細胞RNA異構體測序（scISO-Seq）可以揭示單個細胞中的轉錄本剪接等結構變異研究，但仍存在測序通量低、研究成本高等瓶頸，且轉錄本測序深度覆蓋度低，分析結果相對不準確。

5月6日，華大基因（300676）唐沖博士團隊和中山大學眼科中心眼科國家重點實驗室劉奕志院長團隊共同在Nature Communications（影響因子：17.694）發表名為“High-throughput and high-accuracy single-cell RNA isoform analysis using PacBio circular consensus sequencing”的文章（點擊文末“閱讀原文”查看文獻）。

該研究突破關鍵技術瓶頸，開發了HIT-scISOseq技術，將單細胞多個cDNA串聯建庫，結合PacBio平臺（CCS）測序，以實現高通量和高精度的單細胞RNA亞型測序研究。

(資料圖片僅供參考)

HIT-scISOseq可以助力單個PacBio Sequel II SMRT Cell產出8M數據量，獲得大于1,000萬條的高精度全長轉錄組有效reads，同時利用新開發scISA-Tools分析工具，將HIT-scISOseq多倍通量串聯測序片段用為單細胞cDNA分析，準確度和特異性大于99.99%。

此項研究中應用HIT-scISOseq技術解析表征3,375個角膜緣細胞的轉錄組，揭示其中的細胞類型特異性異構體表達。

關鍵技術路線

采用高通量單細胞分選技術，獲得單細胞全長cDNA序列，利用生物素化的PCR引物對全長cDNA進行擴增，然后使用鏈霉親和素珠捕獲擴增的生物素化的cDNA（圖1），并使用USER酶在cDNA的兩個末端產生粘性末端，進一步使用DNA連接酶連接多個cDNA構建CCS文庫后進行長讀長測序。

圖1 HIT-scISOseq單細胞全長轉錄組數據的技術流程

重要研究成果

●有效數據獲得率高

采用相同的樣本進行不同技術測評顯示結果如下：

1. HIT-scISOseq cDNA特有捕獲技術，可將無效TSO artifact reads從50%降低到8%（圖2b）；

2. HIT-scISOseq有效比對reads數是常規單細胞全長轉錄組技術的平均8.3倍（圖2c）；

3. HITscISOseq得到的單個細胞基因數（或單個細胞UMI數）要明顯高于常規單細胞全長轉錄組數據（圖2g）。

圖2 HIT-scISOseq單細胞全長轉錄組數據性能概述

●細胞類群分析結果與短讀長一致

1. 為了驗證HIT-scISOseq區分不同細胞類型的能力，研究者比較了HIT-scISOseq和RNA短讀長測序在相同的高通量單細胞平臺獲得的角膜緣上皮細胞cDNA樣本上，HIT-scISOseq和短讀長測序平臺之間的cell標簽的UMI計數（Pearson系數r=0.992）和基因的UMI計數（Pearson系數r=0.956）之間存在很強的相關性（圖3a，b）；

2.生物學重復樣本間采用HIT-scISOseq技術獲得單細胞UMI計數也具有較高一致性（Pearson系數r=0.998）（圖3c）；

3.相同樣本在不同測序長度下，細胞聚類結果類型及邊界基本一致（圖3d，e）；

4.細胞條形碼計數的高度一致性，表明HIT-scISOseq 可以可靠地分析高通量單細胞轉錄組（圖3f）；

5.每個細胞類群前15個標記基因的表達并在兩個平臺之間發現了相似的表達模式（圖3h，i）。

這些結果證實，基于HIT-scISOseq的單細胞基因表達譜分析結果與基于短讀長測序的方法的結果相當。

圖3 HIT-scISOseq單細胞全長轉錄組數據進行單細胞基因表達分析

●單細胞轉錄本亞型豐度與已知成分高度一致

為了驗證HIT-scISOseq可以準確量化亞型表達，首先使用SIRV來演示亞型檢測。

1. 使用HIT-scISOseq SIRV同種型數據，顯示混淆率低至0.1066%（1-TPR，圖4b）；

2. 通過將HITscISOseq獲得的觀察值與已知的ERCC異構體豐度數據進行比較來評估異構體量化結果：HIT-scISOseq測得的豐度與已知成分高度一致，相關系數為0.97（圖4a）。

圖4 HIT-scISOseq單細胞全長轉錄組數據進行單細胞異構體水平表達分析

●在識別和量化單細胞亞型方面的能力強

1. 研究者從樣本s1和s2中保留了單細胞水平29,392和31,793個異構體亞型，其中FSM（完全剪接匹配：與參考注釋匹配的異構體）是兩個樣本中最豐富的亞型，并且有相當數量的NNC亞型（已有結果至少一個未注釋：包含至少一個未注釋的剪接位點的同種型），表明HIT-scISOseq可用于改進參考單細胞轉錄本異構體注釋（圖4c）。基于亞型水平的表達，我們觀察到同一個細胞聚類模式如上述基因水平分析（圖4d）；

2. 進一步分析了每個細胞簇的前15個標記亞型，發現其中一些亞型以前未被識別（圖4e）。在每種細胞類型中選擇了2個標記亞型用于表達模式驗證，并且結果顯示這些標記亞型確實呈現細胞類型特異性表達（圖4f，g），證明HIT-scISOseq是能夠有效解析單細胞亞型表達。

總 結

HIT-scISOseq是一種高通量、高精度、技術上可行的方法，可以加速長讀長單細胞轉錄組學新興領域的發展，極大的推動高通量單細胞長讀長測序成本的降低。

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責任編輯：Rex_10